Дворана у палати Свети Роод. Каже да град има немире. Неко њему непознати на челу гомиле - мумари, маскирани, плесачи са звонцима, људи у црним капуљачама - претио је, предвиђао и наговарао народ да не послуша краљицу. Дворишница краљице Риццио потврђује да такође посматра повремено како људи жељно слушају ове проповеди. Страница даље говори да је народ провалио у краљичину капелу узвикујући: „Гнездо паписта!“, Да је браник Дарнлеи, краљичин муж, скочио до олтара и почео да се претвара да је проповед, а људи су му одговорили подругљиво. Краљица Мари Стуарт у очају. Осјећа мржњу људи; већина дворјака је напустила; пита се како њено хришћанство може бити толико другачије од хришћанства народа Шкотске. Риццио предлаже да се одмах припреми декрет којим се кажњавају одговорни за нереде. Марија диктира своју страницу, а страница објашњава да ли треба да унесе име Хеинрицх Дарнлеи, мужа краљице. Мари оклева; она сумња да су га немири инспирисали - на крају крајева, окупљене је предводио краљев ратник. Овде ју Риццио подсећа да је краљица; она је попут сунца и има право да кажњава од Бога. Захтијева да се одмах позове дежурни службеник и објави краљичин декрет. Доуглас улази. Марија му говори да однесе папир краљевском канцелару Мортону, како би он жигосао. Доуглас прегледава декрет и види да нема име краља. Пита краљицу о овоме. Риццио је одговоран за њу. Доуглас се губи. Апелира на краљицу да не користи крваве мере сузбијања, наговештавајући да то види као француски или италијански утицај. Али краљица га хладно подсећа на њену моћ да елиминише субјекте непослушне њеној вољи. Између Рицциоа и Доугласа избија свађа, Доуглас изазива Рицциоа на двобој и куне се да ће сутра убити Венецијанаца. Краљица одлази и одводи Рицциоа. Доуглас је остао сам, разматра двобој. Мортон улази. Доуглас му показује декрет. Мортон је неодлучан: плаши се гнева и краља и краљице. Без жиговања, Мортон лицитира краља. У то време, Хенри је био укључен у разговор са својим рођаком Ницком, који га задиркује чињеницом да краљица има стварну моћ у Шкотској, а Хенри је само њен муж, који краљица бира блиске особе, на пример, овај италијански харфиста Риццио ... У овом тренутку Мортон доноси несрећну уредбу. Краљ у љутњи, он одлучи да убије Риццио-а. Краљ Линдсаи улази на двор, позива краља да лови са новостеченим соколом. Мортон одговара да краљ већ има окупацију данас. Линдсаи се вољно придружује завјери против Риццио-а. Буквално забрањује вечерас убити Рицциоа, јер га мора сутра убити. Затим Хенри, искориштавајући одгоду, шаље жестину астрологу да открије какво је место звезда за његове намере.

Астролог у својој лабораторији (такође је алхемичар) расправља са собом да искуство потврђује узалудност науке, да сврха звезде доминира човеком, одлажући добро и зло. Ницк улази, прелијева духовитошћу, астролог му није инфериоран у духовитости. Ницк извјештава да га је краљ послао да пита о Риццио-овој судбини и каже астрологу да предвиди Риццио-ову смрт. Астролог одговара да ће му звезде рећи, а не људи, и заузврат предвиђа смрт јарца. Са тим одлази. Појављује се страница краљице коју је изазвао астролог. Паге воли своју љубавницу. Астролог му говори да каже краљици да ће данас умрети човек кога воли. "Како, Ботвелл ће данас умрети?" - узвикне страница. Астролог је збуњен. Имао је на уму Риццио-а и журе са страницом да га упозори на ово. Остављен сам, астролог се пита - такође се из звезда показало да је Ботвелл некако мрачно повезан са краљицом - кроз Марс, Сатурн ... Ботвелл улази. Из његовог монолога постаје јасно да се он неочекивано нашао у кући астролога. Схватајући где је стигао, Ботвел пита астролога колико му је остало да живи. Старац одговара да ће три године и да ће Ботвелл бити краљ. Ботвелин извади боцу отрова којом је желео да изврши самоубиство, жели да га баци - и оклева. Заиста, у атмосфери палатских сплетки, свако оружје ће вам добро доћи. Одлази.

Страница говори краљици да ће Риццио ускоро доћи. Краљица га радује - према њеном мишљењу, он је сам остао веран њој. "А Ботвел?" Страница пита. „Ко је Ботвел?“ - краљица је заинтересована. Изненађена страница говори Марији како је, док је пловила, јак ветар скидао ружу с главе краљице, цвет је пао у воду. А онда је један од двораца - Ботвел - упао у чамац и уплашено прогонио веслача да ухвати ружу из воде. Након што је чула причу, Марија шаље страницу да се моли. Она признаје Богу да нема више снаге да се одупре својој љубави према Ботвелл-у. Краљица зна да се на двору сматра заљубљеним у Риццио-а. Риццио улази. Марија извештава о смртној опасности која му прети и хладно се опрости од њега показујући му брод који ће га одвести у Рим. У очају Риццио покушава молити краљицу да откаже одлуку о одласку. Краљица је непоколебљива.

Хајнрих, Мортон и Линдсаи су сазнали за Рицциов предстојећи одлазак и ужурбано се обавезали да ће га убити или пустити да једри. Тада се појављује Доуглас и јавља да је Риццио већ отпловио. Доуглас у очају, чезне за крвавом осветом, његова витешка част је повријеђена. Одједном наиђу на страницу која краљици доноси белешку од Риццио-а - није отишао и биће увече с њом. Уротници му одузму поруку.

Марија је заузета везањем у својој соби. Риццио, који је дошао, објашњава јој да не може отићи, јер има двобој са Доугласом ујутро. Признаје да му не треба живот без њене љубави. Замолио је Марију да му да венац ружа - посадит ће цвеће на олтар у Риму ... Хенри, Доуглас и Диндсаи улазе и убију Риццио-а. Краљица се онесвести. Доугласа погађа срамота и ужас - добровољно се повлачи у егзил. Хенри је забринут да ли ће га краљица мрзити. Линдсаи одводи краља, шапћући му о надолазећем лову. Куеен Ботвелл је позвана од стране краљице. Марија се осјети, види Ботвела и призна своју љубав према њему. Ударац је присиљава да призна да жели Хенријеву смрт и даје јој боцу отрова рекавши да је ово пилула за спавање. Мари даје краљу овај "лек", али отров пије буђон. Међутим, ништа не може зауставити убиствену сплетку - Ботвелл разнесе кућу краља Хенрија. У даљини се чују растући крикови гомиле. Кров се с краљицом крије.